La microscopie optique ( Biologie) 1ère année biologie lmd

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MICROSCOPE OPTIQUE ( PHOTONIQUE)

Le microscope optique un instrument d'optique muni d'un objectif et d'un oculaire qui permet de grossir l'image d'un objet de petites dimensions et donc d'en examiner les détails invisibles à l'œil nu. Il est utilisé en biologie, pour observer les cellules, les tissus, en pétrographie pour reconnaître les roches, en métallurgie et en métallographie pour examiner la structure d'un métal ou d'un alliage.



Histoire



Le premier microscope fut sans doute fabriqué par Hans et Zacharias Janssen, deux fabricants de lentilles néerlandais, en 1590, mais ce point est contesté. Galilée en utilise un de sa conception, en 1615. Le modèle final fut inventé par Antoine van Leeuwenhoek en 1664, puis fut amélioré par Christiaan Huygens.



A contrario d'autres systèmes optiques qui sont définis par leur grossissement optique (télescope) ou leur grandissement (appareil photographique), le terme approprié, pour le microscope, est sa puissance, rapport de l'angle, sous lequel est vu l'objet à travers l'instrument, à la longueur de cet objet.

Ne pas le confondre avec la loupe binoculaire qui n'exigeant pas des échantillons plats de faible épaisseur, ou réfléchissants, permet d'observer des pièces naturelles sans préparation en grossissant l'image d'un facteur peu élevé, mais gardant une vision stéréoscopique propice à l'examen macroscopique révélateur de grains, de criques, de fissures, etc.

Préparation des échantillons

L'échantillon observé doit remplir certaines conditions :

* de planéité, pour que l'objectif en donne une image entière nette, faute de quoi on ne peut en observer qu'une portion restreinte
* en transmission, il doit être de faible épaisseur pour que la lumière le traverse et ne rende visible que quelques éléments (cellules) dans le cas de la biologie ;
* en réflexion, la surface doit être en général polie afin que les rayures ne masquent pas ce que l'on veut observer ;
* les parties à observer doivent pouvoir se différencier :
o différenciation de couleurs par la coloration chimique de solutions standardisées, pour la biologie ;
o attaque chimiques par des acides pour révéler des défauts en métallurgie ;
o d'autres différenciations par l'éclairage en lumière polarisée, en ultra-violet (fluorescence), ou par principe interférentiel, révélant d'autres aspect, invisibles à l'œil nu.

En biologie, il est nécessaire, préalablement, de placer, la coupe de tissu ou le liquide contenant des organismes vivants, entre une lame et une lamelle de verre. L'objectif doit s'approcher de la lame pour la mise au point sans, par maladresse, détruire la préparation devenue très fragile.

Du fait de la préparation, la microscopie optique nécessite une importante quantité d'appareils complémentaires pour la seule destination de l'observation microscopique.

Prenons le cas de la biopsie en médecine et biologie (anatomopathologie) : le diagnostic par microscopie, de pièces biologiques prélévées par biopsie pendant une opération, impose des délais courts. Pour préparer la lame, on utilise un appareil appelé cryotome, une sorte de « trancheuse à jambon », placée dans un cryostat (congélateur), qui permet de découper des tranches très fines du corps qui sera à observer en le refroidissant rapidement, puis en le découpant à l'aide de la lame d'un rasoir spécial, affûté sur une autre machine à plaque de verre à l'aide de pâtes diamantées. Si l'on veut travailler à température ambiante, les délais sont plus longs et imposent des déshydratations et remplacement des eaux supprimées par de la paraffine (24 heures) pour que l'échantillon garde sa rigidité ; ensuite, il est coloré par plusieurs substances d'actions alternées de durée très longues, elles aussi.

Constitution du microscope

* miroir : sert à réfléchir la lumière ambiante pour éclairer l'échantillon par en dessous, dans le cas d'un échantillon transparent (par exemple une lame mince en biologie ou en géologie, ou un liquide) ;
* source de lumière artificielle de meilleure température de couleur et de stabilité et par l'usage d'un condenseur qui permet à cette lumière de remplir d'une façon homogène et régulière le champ observé, et surtout de ne pas faire voir, par son réglage adéquat, les détails mécaniques de la source de lumière (spires du filament de l'ampoule). La source d'éclairage peut être plus élaborée et comporter un boîtier indépendant, éventuellement en lumière polarisée ou ultraviolet, pour faire ressortir certaines propriétés chimiques de la matière, ou éclairer l'échantillon par-dessus (notamment en métallurgie)
* diaphragme : ouverture de diamètre variable permettant de restreindre la quantité de lumière qui éclaire l'échantillon ;
* platine porte-échantillon : où l'on pose l'échantillon ; les pinces servent à tenir l'échantillon lorsque celui-ci est mince (par exemple une lame de verre) ; la platine peut être mobile (gauche-droite et avant-arrière), ce qui permet de balayer l'échantillon et de sélectionner la partie observée ;
* objectifs : lentille ou ensemble de lentilles réalisant le grossissement ; il y a plusieurs objectifs, correspondant à plusieurs grossissements, montés sur une tourelle ; Certains objectifs sont dits à immersion car leur puissance ne peut être atteinte qu'en éliminant la lame d'air entre l'échantillon couvert par la lamelle et la frontale de l'objectif. On utilise pour cela de l'huile de cèdre ou des huiles de synthèse dont l'indice de réfraction est proche de celui du verre.
* mise au point grossière et fine ; pour que l'image soit nette, il faut que l'objet soit dans le plan focal de l'objectif ; ces molettes font monter et descendre l'ensemble objectif-oculaire avec un système de crémaillère, afin d'amener le plan focal sur la zone de l'échantillon à observer ;
* oculaire : lentille ou ensemble de lentilles formant l'image d'une manière reposante pour l'œil ; les rayons arrivent parallèles, comme s'ils venaient de très loin, ce qui permet un relâchement des muscles contrôlant le cristallin ; deux oculaires placés sur une tête dite binoculaire rend plus confortable l'observation (même si elle n'apporte pas de vision stéréoscopique).

L'oculaire peut être remplacé par un appareil photographique (devenant objectif l'appareil est caractérisé par son grandissement et non plus par sa puissance) par, une caméra vidéo pour les objets mouvants (cellules vivantes) ou une caméra CCD pour faire une acquisition numérique. Ceci permet de faire l'observation sur un moniteur (écran de type télévision) et de faciliter l'utilisation et le traitement des images (impression, traitement informatique).

Principe du microscope optique

Le microscope optique se base sur les lentilles pour obtenir une image agrandie de l'échantillon à observer.

On peut faire un microscope simplifié avec deux lentilles convergentes. L'objet à observer est placé devant la première lentille appelée « objectif ». Si l'objet est au-delà de la distance focale, cela forme une image réelle inversée et de taille différente ; l'image est plus grande que l'objet si celui-ci est située à une distance inférieure au double de la distance focale de l'objectif.

La deuxième lentille est l'oculaire : elle est positionnée de sorte que l'image soit dans son plan focal. Ainsi, l'œil observe une image « à l'infini », donc en relâchant les muscles chargés de l'accommodation, ce qui représente un meilleur confort visuel.

Il s'agit d'un système centré dioptrique, composé en partie de doublets pour en corriger certaines des aberrations optiques.